做色譜分析的小伙伴們都知道，反相色譜（RP-HPLC）是應(yīng)用最為廣泛的一種分離模式，它可以分析從低極性到中高極性的多數(shù)化合物，常用的鍵合相類型有C18、C8和苯基等。然而，反相色譜也有它的一個使用局限性：就是一些大極性化合物在常規(guī)反相中保留較弱，從而無法進行后續(xù)的定性與定量分析。
對此我們該采取什么樣的辦法呢？
首先，最容易想到的是通過增加流動相中水相的比例以減弱洗脫強度，從而增加極性化合物的保留。一般來說，分析物的極性越大，流動相中水的比例也需要更高。那么問題來了，對于一些常規(guī)的C18柱在高比例乃至純水相中耐受不好，很容易發(fā)生孔內(nèi)干涸，也就是我們常說的“疏水塌陷”。一旦發(fā)生很容易出現(xiàn)色譜柱保留減弱等問題。
為什么純水相中會發(fā)生疏水塌陷
最為大家接受的一種解釋就是“固定相去濕”理論：
簡單來說，就是因為100%的水相無法進入疏水填料的孔道。硅膠是全多孔球形填料，內(nèi)部有各種微小孔道，疏水的C18長鏈是鍵合到孔里的。如果流動相是極性較弱的甲醇和乙腈等，那么很容易就能進入這些孔道，使填料潤濕（如下圖示）。
但如果流動相是純水相，實驗結(jié)束后，一旦流速停止，推動水溶液流動相進入硅膠孔隙的壓力減小，由于疏水的固定相表面對水的排斥作用，會把孔內(nèi)的水“擠”出孔外，發(fā)生孔內(nèi)干涸。下次做實驗時，由于水和疏水的固定相之間高的表面張力，無法進入孔道（如下圖示）。硅膠球幾乎所有的表面積都在孔內(nèi)，如果硅膠表面未濕潤，即“疏水塌陷”。也就意味著待測樣品無法跟鍵合相接觸，從而導(dǎo)致色譜柱保留性能的降低。
一般來說，孔徑越小的C18柱（孔徑<160?)，越容易發(fā)生“疏水塌陷”，因為C18長鏈在孔內(nèi)彼此舒展，為純水相的通過所留有的間隙很小，即小孔更容易被C18長鏈“封鎖”；而孔徑較大的C18柱（孔徑≥160?)，不用擔心發(fā)生“疏水塌陷”。
為解決小孔徑C18柱不耐受純水的問題，月旭科技的經(jīng)典色譜柱Ultimate AQ-C18應(yīng)運而生。該色譜柱以極性官能團作為封端試劑，是一款耐100%水相的水性柱而不會出現(xiàn)“疏水塌陷”，在高含水量的流動相中能保持更長的使用壽命。
產(chǎn)品特點
● 采用純度>99.999%的B型超高純?nèi)嗫浊蛐喂枘z；
● 適度的表面覆蓋率和完全封尾，使其與高含水量流動相具有很好的兼容性；
● 載碳量12%，孔徑120?，粒徑3μm、5μm、10μm；
● 完美的峰形、更高的塔板數(shù)、適當?shù)闹鶋骸?/p>
在大極性化合物分析中的表現(xiàn)
有機酸在中草藥和水果的葉、根、特別是果實中廣泛分布，如烏梅、五味子等。它也常作為防腐劑和穩(wěn)定劑被加入到食品和飲料中。通常使用HPLC對其進行質(zhì)量分析和含量檢測。然而，由于有機酸極性較強，在不添加離子對試劑情況下，需提高水相比例甚至100%純水相，來增加其保留。此時，AQ柱便可大顯身手。
應(yīng)用案例一
四種有機酸測定
液相色譜條件
色譜柱：Ultimate AQ-C18（4.6×250mm，5μm)
流動相：A：磷酸鹽緩沖液；B：乙腈
柱溫：30℃
檢測波長：210nm
流速：1.0mL/min
進樣量：20μL
梯度洗脫：
配方顆粒來源于中藥飲片的水提物，可檢出組分（如核苷、有機酸、水溶性維生素、生物堿等）極性較強。此時亦可考慮使用AQ-C18柱，可以從大比例或100%的水相開始進行梯度淋洗。
應(yīng)用案例二
板藍根顆粒含量測定
參考標準：中國藥典2020版一部
色譜柱：Ultimate AQ-C18（4.6×250mm，5μm)
流動相：A：水；B：甲醇
柱溫：30℃
檢測波長：254nm
流速：0.8mL/min
進樣量：5μL
梯度洗脫：
溫馨提醒：如果您使用普通C18色譜柱，偶爾做了高水相的方法，或者不小心用純水沖了色譜柱，導(dǎo)致“疏水塌陷”，也不用太擔心，這并不代表這支柱子從此就廢了。使用高有機相沖洗一段時間，基本都可以將色譜柱恢復(fù)正常。例如：使用純甲醇或純乙腈0.1mL/min流速沖洗過夜，即可恢復(fù)色譜柱性能。
